通脉颗粒在急性心肌缺血模型比格犬体内药动学研究(2)

　　1 材料
　　液相质谱联用仪（API 4000QTRAP）为美国Applied Biosystem公司产品，配有Turbo VTM离子源仓、离子喷雾和大气压电离离子源以及Analysis 1.4.2数据处理系统；高效液相系统为Agilent 1200系统，配置包括G1322A 脫气机，G1311A四元梯度泵，G1329A自动进样器，G1316A柱温箱，G1330B进样盘温控器，G1314B检测器，美国Agilent公司产品；台式高速冷冻离心机（MIKRO 22R），德国Hettich公司产品；氮吹仪（Model 18780），美国PIERCE公司产品。
　　通脉颗粒由河北省神威药业有限公司生产（批号20100914）；丹参素（DSS）、迷迭香酸（RA）、紫草酸（LA）、丹酚酸A（SAA）和阿魏酸（FA）对照品购自天津一方科技有限公司（批号201004）；丹酚酸B（SAB，111562-200807）、柚皮苷（NAR，110722-200610）对照品购自中国食品药品检定研究院；芒柄花素（TM6）、大豆苷元（TMF1）、原儿茶醛（TMF2）、反式阿魏酸（TMF3）、大豆苷（TMF6）、3′-甲氧基葛根素（TMF7）、葛根素（TMF10）、芹糖基葛根素（TMR2）及3′-羟基葛根素（TMR3）对照品由北京大学药学院杨秀伟教授课题组分离提供，纯度均大于98%。质谱分析用甲醇和乙腈均为色谱纯，由德国Merk公司生产。流动相用甲酸为美国J T Baker公司生产，其他样品处理用试剂为分析纯，由北京化学试剂公司生产；抗坏血酸由国药集团化学试剂有限公司生产；液质分析用水为娃哈哈纯净水。
　　Beagle犬雌雄各半，体重9～14 kg，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号SCXK（京）2010-0001。Beagle犬给标准饲料和水，饲养于中国中医科学院西苑医院动物室。
　　2 方法与结果
　　2.1 犬血清中各成分分析方法的建立
　　2.1.1 对照品储备液的配制精密称量丹参素对照品10 mg，用50%甲醇配制成1 g·L^-1的储备液，于 -20 ℃冰箱中保存备用。分别精密称量10 mg的迷迭香酸（RA）、紫草酸（LA）、丹酚酸A（SAA）、丹酚酸B（SAB）、阿魏酸（FA）、芒柄花素（TM6）、大豆苷元（TMF1）、原儿茶醛（TMF2）、反式阿魏酸（TMF3）溶、大豆苷（TMF6）、3′-甲氧基葛根素（TMF7）、葛根素（TMF10）、芹糖基葛根素（TMR2）、 3′-羟基葛根素（TMR3）对照品用甲醇配制成1 g·L^-1的储备液，于-20 ℃冰箱中保存备用。
　　2.1.2 混合对照溶液和其他工作液的配制取上述标准溶液，以甲醇稀释至100 mg·L^-1，分别吸取20 μL，合并至1 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，配制成5 mg·L^-1的混合对照溶液于冰盒中待用。量筒量取浓盐酸溶液（4 mol·L^-1）10 mL至具塞锥形瓶中，加入30 mL水混合均匀，使其浓度为1 mol·L^-1，置于4 ℃冰箱中待用。称量抗坏血酸粉末50 g至烧杯中，量取250 mL水溶解粉末，待全部溶解后转移至棕色瓶中，避光放置于4 ℃冰箱中待用。
　　2.1.3 血清样品处理 100 μL血清首先依次加入1 mol·L^-15 μL和20%抗坏血酸溶液30 μL，涡旋震荡仪2档下混匀0.5 min，加入乙酸乙酯1 200 μL，涡旋混匀3 min，静置2 min，12 000 r·min^-1，20 ℃离心10 min，取上层有机层1 000 μL，氮气吹干（40 ℃），用100 μL含10%甲醇-乙腈（1∶1）的水溶液（含甲酸0.1%）复溶，涡旋3 min，于12 000 r·min^-1，20 ℃离心10 min，取上层10 μL进样。
　　2.1.4 LC-MS/MS条件分析色谱柱为Merck Chromolith RP-18e 2 mm×50 mm（2 μm）整体柱，前面连接0.2 μm孔径的在线过滤器，柱温为10 ℃。流动相A为0.07%甲酸水，B为乙腈-甲醇（1∶1），含0.07%甲酸，梯度洗脱，0～0.3 min，5%～20%B，0.3～3.3 min，20%～55%B，4.5～4.6 min，55%～5%B，流速0.5 mL·min^-1。
　　质谱分析采用ESI-检测，离子源参数设置为Curtain gas：20 Pa；Gas1：55 Pa；Gas2：55 Pa；Collision gas（CAD）：Medium；温度为 600 ℃；Ion spray voltage：-4.5 kV。化合物相关参数见表1。
　　2.2 犬血清样品分析方法的验证
　　2.2.1 分析方法的专属性取犬空白血清100 μL，以2.1.3项下方法操作，获得空白样品谱图。取犬空白血清加入混合对照品后，以2.1.3项下方法操作，得空白外加对照品谱图。急性心肌缺血模型比格犬十二指肠给予通脉颗粒后，以2.1.3项下方法操作，得实测样品谱图。结果表明，空白血清中内源性物质不干扰测定。有不少成分在给药后血清中出现多个峰，如TMF2，TM6，TMF6等，这些峰可能来自于还未分离到的或体内代谢转化形成的同分异构体。

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